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Alors que CRISPR-Cas9 entre dans les tests humains, le rythme effréné des progrès de la recherche préclinique offre une variété déconcertante d’options pour l’édition de gènes thérapeutiques.

En mars, alors que le monde faisait face à l’attaque COVID-19, un autre type d’histoire médicale était en cours au Casey Eye Institute de l’Université de l’Oregon pour la santé et les sciences. Le pionnier de l’édition de gènes Editas Medicine et Allergan ont annoncé qu’un patient avait reçu le premier CRISPR-Cas9 thérapie in vivo – un traitement pour une forme d’amaurose congénitale de Leber. Quelques jours seulement auparavant, des résultats positifs premier essai clinique de cellules T éditées ex vivo en utilisant CRISPR-Cas9. Au moins 20 autres essais humains sont en cours pour étudier la sécurité de l’édition de CRISPR-Cas9 chez l’homme, la plupart d’entre eux s’appuyant sur des mécanismes de réparation de l’ADN cellulaire pour cliver l’ADN dans les cellules des patients. Avec le rythme rapide de la recherche explorant une gamme croissante d’enzymes et de fusions CRISPR conçues, les efforts de traduction devraient se diriger rapidement vers un objectif plus ambitieux: la correction directe des lésions génétiques.

L’accent dans ce numéro explore les derniers développements des outils et thérapies CRISPR. Aujourd’hui, l’omniprésence de ces réactifs d’édition de gènes dans les laboratoires du monde entier est un fait. Mais il est remarquable que les thérapies CRISPR-Cas9 soient entrées dans les tests humains si peu de temps après leur découverte initiale.

En 2012, l’importance du CRISPR-Cas9 en tant que système de défense immunitaire bactérienne pour la protection contre les attaques de phages a été clarifiée. Mais aucune cellule humaine n’avait été exposée aux protéines CRISPR par conception. Personne ne savait si ces protéines procaryotes fonctionneraient dans les cellules humaines et quelles voies de réparation seraient impliquées. Personne ne savait si l’action de CRISPR-Cas9 serait toxique pour les cellules humaines. Et personne ne savait si ces grandes protéines d’édition de gènes pouvaient être délivrées aux cellules, aux tissus et aux organes du corps.

En 2020, nous maîtrisons mieux ces questions. Nous comprenons que CRISPR – Cas9 peut créer des insertions / suppressions (1 à 100 bp indels) ou des insertions dirigées sans homologie (≥1 kb) dans une rupture double brin (DSB) ou des suppressions dirigées entre deux DSB (10 bp à plusieurs kb) à la suite d’une liaison finale non homologue médiée par une réparation de mésappariement. En divisant les cellules, la réparation dirigée par l’homologie (HDR) peut également effectuer des insertions de gènes ciblées via un donneur et une construction DSB. Les études précliniques déterminent les effets de la phase du cycle cellulaire, du développement cellulaire, de la différenciation, de l’âge ou du statut métabolique sur l’activité d’édition des gènes. Cela dit, la dépendance de CRISPR-Cas9 vis-à-vis des enzymes de réparation cellulaire, présentes à différents niveaux à différents moments dans différentes cellules, et la difficulté de fournir des composants à l’organisme signifient que l’édition génique in vivo reste un travail en cours. (Intellia Therapeutics et Regeneron ont l’intention de tester l’injection systémique à l’aide de nanoparticules lipidiques pour l’amylose transthyrétinique an.)

En revanche, l’édition génique ex vivo devient courante. En utilisant l’électroporation et les ribonucléoprotéines, CRISPR-Cas9 peut générer des indels par la liaison d’extrémités non homologues dans les cellules souches hématopoïétiques humaines et les cellules T primaires avec des efficacités plus de 80%. Même le Saint Graal de la correction génétique par HDR peut atteindre des fréquences supérieures à 30% dans les cellules en division.

Il y a aussi un optimisme croissant qu’un ensemble en plein essor de protéines Cas (comme SaCas9, Cas12a, Cas12b, Agile et Cas9 – Sc++) et ses variantes d’ingénierie associées aux fusions d’enzymes peuvent porter la modification des gènes à de nouveaux sommets, abordant les effets hors cible, les contraintes PAM, les fenêtres d’activité, les inefficacités de la correction des gènes et le manque de HDR dans les cellules qui ne se divisent pas (par exemple, les neurones postmitotiques).

Édition de la base d’ADN: un processus d’abord décrit dans 2016 l’utilisation de cas9 ou de nickase Cas9 catalytiquement inactifs fusionnés à une désaminase (et, dans le cas des éditeurs à base de cytidine, une fusion supplémentaire d’inhibiteur d’ADN glycosylase) – permet la conversion directe d’un seul nucléotide en un autre sans DSB . Jusqu’à présent, les options sont limitées aux changements de C en T et de A en G, mais d’autres éditeurs de base sont en cours de développement. Les mutations ponctuelles contribuent à environ la moitié de toutes les mutations pathogènes connues, et les éditeurs de bases actuels peuvent traiter ~ 60% des polymorphismes mononucléotidiques liés à la maladie (~ 50% de toutes les mutations ClinVar) Beam Therapeutics, qui prévoit de soumettre sa première demande pour un nouveau médicament expérimental l’an prochain, mène des programmes cliniques pour la traduction des éditeurs de base en thérapeutique.

Si davantage de changements de nucléotides simples sont nécessaires, une solution récente peut se présenter sous la forme de édition principale. Cette approche exploite la transcriptase inverse fusionnée avec une maison de nickase pour remplacer une partie de la séquence autour d’une coupe à un seul brin à l’aide d’un ARN guide étendu. Jusqu’à présent, il a été démontré que la méthode installe toutes les mutations de paires de bases simples et les indels courts possibles (<100 pb). Il promet une plus grande flexibilité d'orientation et une plus grande précision d'édition que l'édition de base, mais avec une efficacité d'édition plus faible jusqu'à présent et une augmentation des sous-produits autonomes. Le développement clinique est en cours dans la startup Prime Medicine.

Les transposases (enzymes qui catalysent l’insertion d’ADN mobile dans l’ADN hôte) et les recombinases (enzymes qui catalysent les réarrangements des segments d’ADN) sont deux autres groupes d’enzymes qui promettent une édition de gènes plus prévisible. . Jusqu’à présent, la spécificité de la séquence modifiée sans compromettre l’activité s’est révélée insaisissable pour les recombinases, bien que les transposases associées à Cas12k ou la Système CRISPR-Cascade ils ont maintenant été conçus pour attaquer des séquences arbitraires et catalyser l’insertion de plusieurs kilobases d’ADN dans des bactéries.

Une approche complètement différente, qui évite les inquiétudes concernant les changements hors cible permanents du modèle d’ADN, consiste à utiliser le mécanisme CRISPR pour modifier l’ARN, qui se décompose au fil du temps. En plus de différentes approches de coopter l’ADAR endogène (adénosine désaminase agissant sur l’ARN), dCas13b il peut être fusionné avec ADAR directement pour induire l’adénosine à éditer l’inosine aux sites désirés. Plusieurs sociétés, dont Locana, Beam, Korro Bio, ShapeTx, EdiGene et ProQR, suivent des approches d’édition d’ARN.

Dans l’ensemble, le nombre d’approches ciblées mises en ligne pour manipuler les acides nucléiques dans les cellules est stupéfiant. Avec les endonucléases à doigts de zinc, les nucléases effectrices transcriptionnelles (TALEN) et les méganucléases, CRISPR-Cas promet aux patients une gamme toujours plus étendue d’options d’édition de gènes pour traiter des maladies précédemment intraitables et hautement génétiques pénétrant.

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L’avant-garde clinique.
Nat Biotechnol 38, 767 (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0612-2

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